實驗新手講解自己的ELISA操作流程，您沒見過吧，本章就由我司一個客戶朋友親身講講他自己的實驗經歷。讓我們一起閱讀！
給師弟科普ELISA基本步驟。與其寫個文檔，不如直接寫帖子，反正工作量一樣。我自己做ELISA也只是初學者，所以說得不對的地方，請大家多多指正。
ELISA有白底（上圖，不可拆）和黑空板子（可拆，8個一排，12排）。用吸光度（一般是450nm的OD值）來檢測，就只能用白底的板子。黑底的板子可以用Lumin讀數。
步，拿到板子，還有封蓋膜。
第二步：用100ul包被抗體，包被好板子之后，輕彈混勻。將封蓋膜的白色撕去，用透明有粘性的膜，貼在板子上，把膜壓緊（貼膜是為了防止液體揮發，所以一定要把每孔黏牢）。
室溫孵育過夜。
注意事項：
1.如果一次只做一部分孔，貼膜可以剪刀剪開，只用一部分。保證膜可以把加液后的孔蓋住就可以。
2.加樣時候，一定要保證每孔加樣量完全一樣。避免因為操作原因，每孔液體量有區別。ELISA比較敏感，操作誤差會導致*后讀數有不小的差別。
3.加的樣，保證樣品加在孔底，不要粘在管壁上，減少孔與孔之間的差異。
第二天早上，來洗掉包被液。
注意事項：
1. ELISA用的所有液體系統，記得一定要預先調PH值到7.2-7.4之間，按照說明書都無菌過濾過。1XPBS的PH值在7.68左右，仍然需要加鹽酸調酸一點。Trizma base配出來，PH在9.98,必須調PH!否則ELISA中抗原抗體根本不能正常結合。蛋白對于PH值極度敏感。
2. 無菌要求多高，現在不知道。建議無菌配好的液體放在4度冰箱保存。每次用之前，放在室溫下至少15分鐘。ELISA用的液體，室溫的溫度，效果比較好。
洗包被液的時候，直接把板子翻過來，棄掉液體。在厚厚的吸水紙上，用力拍打板子，力求把孔中的液體完全棄干凈。
用WASH BUFFER洗滌三次。因為孔的容量是400UL,但是300UL基本就可以把孔覆蓋滿。所以，建議洗板子的時候，每孔加350ul左右。
注意事項：
1.每次洗滌的時候，盡量拍干孔中液體。這樣洗滌得比較干凈。
2. 孔中沒有液體時候，動作一定要快�。�！ELISA包被后的孔，絕對不能干掉！否則非常影響結果。

3.封閉。
用是1%BSA in 1XPBS. 無菌過濾，4度保存，用之前放在室溫復溫。
封閉液可以封閉全孔，所以每孔加300UL封閉液，室溫1小時。

4. 棄掉封閉液，拍干。
洗滌三遍。步驟如前。

5. 加標準品和樣品。
標準品儲存濃度很高，而且蛋白很忌反復凍融。建議次使用時，分裝�？梢�48孔一只，-80度冰箱保存，可以有效保存半年。4度保存，有效期是60天，而且濃度會衰減。
取16孔標準品的量。舉例，我的標準品儲存濃度是270ng/ml, 標準品分7個點，濃度是1000pg/ml，每孔100ul, 2倍遞減，所以是1000， 500， 250， 125， 62.5 ， 31.2， 15.6 pg/ml, 7個孔我需要0.2ng標準品。
做ELISA必須有復孔。所以，兩排14個孔我需要0.4ng標準品, 1.5ul。
標準品稀釋步驟：
取7個EP管，第1管放400ul緩沖液，第2到7管放200ul緩沖液。將1.5ul標準品加入到管中，200ul槍輕輕吹打混勻。從第1管中取200ul加入第2管中，吹打均勻。依次稀釋。第7管有400ul液體，*后只用200ul。
標準品加樣步驟：
從第1管中取100ul加到A1孔，再100ul加到A2復孔中。
第2到7孔，參考上述步驟。
第8孔，H1和H2加沒有標準品的緩沖液，作為陰性對照。
樣本加樣：
血清或者細胞上清，解凍之后混勻，建議3000RPM離心10分鐘，沉淀液體中的固體雜質。
按照順序，每孔加100ul樣本，記得做復孔。加樣體積一定要一樣，但是動作要快。樣本還是一定要保證加到管底，不要粘附到管壁上。

標準品和樣品，每孔100ul，室溫孵育2小時。
6. 棄掉液體，拍干。洗滌3遍。
7. 加檢測抗體（detection antibody,尾端有生物素biotin），每孔100ul（儲存液也是放-80度，用之前解凍后加緩沖液混勻，稀釋到工作濃度，緩沖液的PH值都已經調到7.2-7.4之間）。
室溫孵育2小時。
備注：以上這些步驟沒有要求避光。所以，每次加樣之后，只要保證把貼膜都貼牢，防止液體蒸發和孔間干擾即可。
板子可以放在操作臺上。
不過因為操作習慣，即使不避光的步驟，也可以把板子放在室溫的抽屜里。

8.棄掉檢測抗體液，拍干。
洗滌三遍。
9. 加Streptavidin-HRP(親和素-辣根過氧化物酶)，這個一直4度保存，使用的時候200倍稀釋（96孔，9.6ML液體，加48ul的Streptavidin-HRP，9552ul的緩沖液）。
100ul每孔，室溫，避光（這步開始要避光），孵育20分鐘。
10. 棄掉液體，拍干。洗滌三遍。
11. 加底物液（substrate solution）,A液：B液=1:1，用之前臨時混起來。儲存的時候A，B兩液分別儲存在4度冰箱。
每孔100ul（等于每孔A液50ul，B液50ul），室溫，避光，20分鐘。
說明：
1. 加AB液之后，白色的孔就會顯色。淡綠色，顏色深淺跟目標蛋白濃度正相關。
2. 生物素與親和素結合，可以放大免疫反應的效應，便于顯色。
3.ELISA包被的板子采用平底（flat），大概60個96孔板，260美元左右。
白色的板子雖然不能拆卸，但是不用的孔，只要別污染，下次可以用，所以一塊板子等同于可以拆開來用。
12. 保留AB液在孔內，直接每孔加50ul的終止液（2N H2SO4）。終止液也是公司買的專門ELISA用的。
加完終止液，輕彈板子，混勻�？梢钥匆姷�綠色變為亮黃色。黃色的顏色深淺，與綠色一致，與目標蛋白的濃度成正相關。
加完終止液，立即到機器上讀數。選擇450nm，測OD值。
說明：不常做ELISA的實驗室，請務必在實驗之前，確認吸光度檢測儀器在正常使用狀態。如果儀器狀態不好，讀數不準，ELISA的結果也不可信。
附圖的板子顏色，是我昨天的結果，室溫放了一個晚上之后，今早來看，
顏色普遍都黃色，雖然還有顏色深淺的區別。
剛做出來的時候，顏色淡的近乎白色，幾乎沒有黃色。


X,Y軸都取對數之后，可以看見點與點之間成直線。
但是，R2只有0.967，一般比較好的標準曲線，應該是0.99左右。
D1與D2的重復性不好（標準品濃度，125pg/ml），可能是個人操作原因。
根據標準品得到的公式，就可以根據OD值來計算各個樣本檢測濃度。

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